Barvanje po Gramu - definicija in postopek Gramove metode

Barvanje po Gramu (ali Gramova metoda) je način razvrščanja bakterij v dve veliki skupini: grampozitivne in gramnegativne. Ime izhaja iz imena njenega izumitelja Hansa Christiana Grama.

Gramova metoda obarva bakterije glede na kemične in fizikalne lastnosti njihovih celičnih sten. Postopek temelji na tem, da kristal vijoličen v kombinaciji z jodom (mordantom) tvori velike komplekse, ki se v debeli plasti peptidoglikana zadržijo, medtem ko jih tanjša plastična stena pri gramnegativnih bakterijah ob dekolorizaciji z alkoholom spere. Po končnem kontrabarvanju s safraninom ali fuksinom so grampozitivne bakterije vijolične, gramnegativne pa rdeče ali rožnate.

Glavni reagenti

• Kristal vijoličen (primary stain) — prvi barvilni korak.
• Jod (mordant) — tvori kompleks s kristal vijoličnim, poveča pritrjevanje barvila v peptidoglikanu.
• Alkohol ali acetonski alkohol (dekolorizator) — izpere kompleks iz bakterij z manjšo plastjo peptidoglikana (gramnegativne).
• Safranin ali fuksin (kontrastno barvilo) — obarva dekolorizirane bakterije v rožnato/rdeče barve.

Korak-po-korak postopek

• Priprava preparata: tanka namazna slika bakterijske kulture na stekleni predmet; sušenje na zraku.
• Fiksacija: kratko segrevanje (heat-fix) ali kemična fiksacija, da se bakterije prilepijo na predmet in uničijo mikroorganizme.
• Prvo barvanje: nanese se kristal vijoličen (običajno 1 min).
• Mordant: doda se jodov raztopina (1 min) — nastane kompleks kristal vijoličen–jod.
• Dekoloracija: kratko izpiranje z alkoholom ali acetonskim alkoholom (10–30 s; čas je kritičen).
• Kontrastno barvanje: obarvanje s safraninom (30–60 s) ali fuksinom in izpiranje.
• Sušenje in mikroskopija: pregled pri oljni imerziji (100× objektiv) — interpretacija barve.

Razlaga rezultatov

• Grampozitivne bakterije: vijolične do temno vijolične — zaradi debele plasti peptidoglikana, ki zadrži kompleks kristal vijoličen–jod.
• Gramnegativne bakterije: rdeče ali rožnate — tanke stene peptidoglikana in zunanja membrana omogočata izpiranje kompleksa med dekolorizacijo, zato jih obarva kontrastno barvilo.

Zakaj metoda deluje (strukturni razlogi)

Glavni dejavnik je debelina in sestava peptidoglikanske plasti ter prisotnost zunanje membrane pri gramnegativnih bakterijah. Grampozitivne bakterije imajo debelo peptidoglikansko plast in v njej tehoične kisline, kar omogoča zadržanje vijoličnega kompleksa. Gramnegativne imajo tanjšo plasti peptidoglikana in dodatno zunanjo membrano z lipopolisaharidi (LPS), zaradi česar se kompleks lažje izpira pri dekolorizaciji.

Omejitve in izjeme

• Gram-variabilne ali nedoločljive bakterije: nekatere vrste ne dajejo zanesljivega rezultata s to metodo.
• Bakterije z nezadostno ali spremenjeno celično steno (npr. Mycoplasma brez celične stene) ne obarvajo po pričakovanjih.
• Azijske kisline in lipidne ovojnice (npr. Mycobacterium) preprečijo standardno Gram barvanje — potreben je acidorezistenten postopek (Ziehl–Neelsen).
• Stare kulture ali slabo pripravljeni preparati lahko prikažejo napačne rezultate (grampozitivne bakterije, ki postanejo gramnegativne pri starejših kulturah).

Klinični pomen

Barvanje po Gramu je pogosto prvi in hiter diagnostični korak pri pregledu bolnikovih vzorcev (npr. krvi, izcedek, bris, sputum). Pomaga hitro usmeriti izbiro antibiotičnega zdravljenja in nadaljnje laboratorijske teste. Vendar ne nadomešča nadaljnje kulture, identifikacije ali antibiograma.

Nasveti za zanesljive rezultate in pogoste napake

• Pripravi tanek in enakomeren namaz — predebatni ali predebel namaz oteži barvanje.
• Ne pregrevaj pri fiksaciji — lahko uniči strukturo bakterij.
• Natančno kontroliraj čas dekolorizacije — preveč dekolorizacije lahko naredi tudi grampozitivne celice videti gramnegativne, premalo pa lahko povzroči, da gramnegativne ostanejo vijolične.
• Uporabi kontrolne sev (poznan grampozitivni in gramnegativni organizem) za primerjavo in nadzor postopka.

Več o zgodovini

Gram je to tehniko razvil v sodelovanju z drugim znanstvenikom Carlom Friedländerjem v bolnišnici v Berlinu. Vendar je Gram test najprej uporabil, da bi olajšal opazovanje bakterij v pljučih. Svojo dokončano metodo je objavil leta 1884.

Barvanje po Gramu ostaja osnovno orodje v mikrobiologiji zaradi hitrosti, enostavnosti in koristnih informacij o morfologiji ter osnovni celični strukturi bakterij. Kljub temu je treba rezultate vedno interpretirati v kontekstu kliničnih podatkov in dodatnih laboratorijskih preiskav.

Vprašanja in odgovori

V: Kaj je barvanje po Gramu?

V: Kdo je izumil barvanje po Gramu?

V: Kako deluje obarvanje po Gramu?

V: Zakaj je Gramovo barvanje pomembno?

V: Ali lahko vse bakterije razvrstimo z barvanjem po Gramu?

V: Za kaj je Gram sprva uporabljal obarvanje po Gramu?

V: Kdaj je bila objavljena metoda Gramovega barvanja?

Išči po črki