Rentgenska kristalografija: definicija, metoda in uporaba za določanje strukture
Rentgenska kristalografija je način za prikaz tridimenzionalne strukture molekule. Elektronski oblak atoma rahlo upogne rentgenske žarke. Tako nastane "slika" molekule, ki jo je mogoče videti na zaslonu. Uporablja se lahko za organske in anorganske molekule. Vzorec se pri tem ne uniči.
Tehniko sta skupaj izumila sir William Bragg (1862-1942) in njegov sin sir Lawrence Bragg (1890-1971). Leta 1915 sta prejela Nobelovo nagrado za fiziko. Lawrence Bragg je najmlajši Nobelov nagrajenec. Bil je direktor Cavendishovega laboratorija na Univerzi v Cambridgeu, ko so februarja 1953 James D. Watson , Francis Crick , Maurice Wilkins in Rosalind Franklin odkrili strukturo DNK.
Najstarejša metoda rentgenske kristalografije je rentgenska difrakcija (XRD). Rentgenski žarki se izstrelijo v posamezen kristal in glede na njihovo razpršitev nastane vzorec. Ti vzorci se uporabljajo za ugotavljanje razporeditve atomov v kristalu.
Princip delovanja
Rentgenski žarki interagirajo z elektronskim oblaki atomov v vzorcu. Ko valovi rentgenskega sevanja naletijo na periodično razporejene ravni atomov v kristalu, se delno razpršijo. Ko so razpršeni valovi v fazi, pride do konstruktivne interferenčne ojačitve, kar zabeleži detektor kot pikčast difrakcijski vzorec. Pojasnilo tega pojava daje Braggov zakon: nλ = 2d sinθ, kjer je λ valovna dolžina rentgenskega sevanja, d razdalja med ravninami v kristalu, θ kot upada in n celo število reda refleksije.
Glavne metode
- Enokrystalna rentgenska difrakcija (single-crystal XRD): uporablja se za določanje natančnih atomskih položajev v enkratnem kristalu. Omogoča najvišjo ločljivost in je zlat standard za določanje molekularnih geometrij.
- Praškasta rentgenska difrakcija (powder XRD): primerna za materiale, ki jih ni mogoče dobiti kot velike enokriste, in za fazno identifikacijo ter analizo sorazmerij večfaznih zmesi. Rezultate pogosto obdelamo z Rietveldovo refinacijo za določitev kristalne strukture in deležev faz.
- Rentgenska difrakcija na monokristalih z rentgenskim difraktometrom: sodobni laboratorijski in sinhrotroniški difraktometri z območji hlajenja (cryocooling) omogočajo hitro zbiranje podatkov in zmanjšanje sevanja (radiation damage).
Koraki pri določanju strukture
- Priprava vzorca: rast kakovostnega kristala (velikosti mikrometrov do milimetrov). Pri praškastih vzorcih je pomembna homogenost in primerna velikost delcev.
- Namestitev in hlajenje: kristal se pričvrsti na iglo ali kapilaro; pogosto se hladi do ~100 K za zmanjšanje radijacijskih poškodb.
- Zbiranje podatkov: rotacija kristala in zajem difrakcijskih pik z detektorjem pri različnih kotih. Sinhrotroni omogočajo zelo kratke eksponacijske čase in visoko intenziteto.
- Indeksiranje in integracija: določitev mrežnih parametrov in intenzitet refleksov.
- Reševanje faznega problema: ker detektor zabeleži le intenzitete (amplitude), je treba obnoviti faze. Uporabljajo se metode neposrednih (direct methods), Pattersonjeve funkcije ali molekulske zamenjave (molecular replacement) pri biomolekulah.
- Refiniranje strukture: prilagoditev modela atomov tako, da najbolje pojasni meritve (least-squares, restrikcije, parametri toplotnega premikanja). Rezultati se ocenijo z merili, kot so R-faktor in goodness-of-fit.
- Interpretacija gostote elektronov: iz dobljenih faz in intenzitet se izračuna gostota elektronov, po kateri se zgradi atomski model.
Prednosti in omejitve
- Prednosti: rentgenska kristalografija daje zelo natančne 3D koordinate atomov, vezi in geometrijo molekul; primerna je za širok spekter snovi (organske, anorganske, kompleksne biomolekule).
- Omejitve: zahteva urejene (periodične) vzorce — enokrstali ali dobre praške; težave pri določanju položaja vodikovih atomov, ker imajo zelo malo elektronov; emisijska poškodba občutljivih bioloških vzorcev (radiation damage), ki jo blažijo hlajenje in sinhrotronska hitra merjenja.
- Dopolnilne metode: nevronska difrakcija (bolje zazna vodik/njihove izotope), kriogenicna elektronska mikroskopija (cryo-EM) (ni potrebe po kristalizaciji pri velikih biomolekulah) in spektroskopske tehnike za dodatne informacije.
Uporaba
- Strukturna biologija: določanje 3D struktur beljakovin, nukleinskih kislin, ligandov in kompleksov; ključna za razumevanje mehanizmov delovanja in za oblikovanje zdravil.
- Kemija in farmacija: določanje stereokemije, obračanja, konformacij in interakcij med molekulami; preverjanje čistoče in solidnih oblik (polimorfi).
- Materialna znanost in mineralogija: določitev kristalnih faz, napak, lastnosti katalizatorjev in konformacij v trdnih snoveh.
- Industrija: karakterizacija novih snovi, potrjevanje struktur sintetičnih produktov, nadzor kakovosti.
- Forenzika in arheologija: identifikacija neznanih snovi ali rekonstruiranje struktur iz majhnih vzorcev.
Praktični nasveti
- Za biokristale je pogosto ključno preizkušanje mnogih pogojev kristalizacije; majhne spremembe v pH, soli ali temperaturi lahko izboljšajo kakovost kristalov.
- Uporaba sinhrotronskega sevanja je priporočljiva za majhne ali slabo razpršujoče kristale zaradi višje intenzitete in možnosti prilagoditve λ.
- Rezultate je smiselno verificirati z neodvisnimi meritvami in jih, kadar je primerno, naložiti v javne zbirke (npr. PDB, CSD) za preglednost in nadaljnjo uporabo.
Rentgenska kristalografija ostaja osnovno orodje za natančno določanje struktur pri širokem spektru znanstvenih disciplin. Kljub omejitvam jo dopolnjujejo in nadgrajujejo druge tehnike, kar omogoča celostno razumevanje strukture in funkcije materialov ter biomolekul.
Rentgenski difrakcijski vzorec kristaliziranega encima. S pomočjo vzorca pik (odbojev) in relativne moči vsake točke (intenzivnosti) se določi struktura encima.
Rentgenski difrakcijski vzorec kristaliziranega encima. S pomočjo vzorca pik (odbojev) in relativne moči vsake točke (intenzivnosti) se določi struktura encima.
Rentgenska analiza kristalov
Kristali so pravilne razpredelnice atomov, kar pomeni, da se atomi vedno znova ponavljajo v vseh treh dimenzijah. Rentgenski žarki so valovi elektromagnetnega sevanja. Ko se rentgenski žarki srečajo z atomi, elektroni v atomih povzročijo, da se rentgenski žarki razpršijo v vse smeri. Ker se rentgenski žarki oddajajo v vse smeri, rentgenski žarek, ki naleti na elektron, povzroči sekundarno sferično valovanje, ki izhaja iz elektrona. Elektron se imenuje razpršilnik. Pravilen niz razpršilcev (v tem primeru ponavljajoči se vzorec atomov v kristalu) ustvarja pravilen niz sferičnih valov. Čeprav se ti valovi v večini smeri med seboj izničijo, se v nekaj posebnih smereh, ki jih določa Braggov zakon, seštevajo:
2 d sin θ = n λ {\displaystyle 2d\sin \theta =n\lambda } 
Pri tem je d razmik med difrakcijskimi ravninami, θ {\displaystyle \theta }
je vpadni kot, n je poljubno celo število, λ pa je valovna dolžina žarka. Te posebne smeri se pojavijo kot pike na difrakcijskem vzorcu, ki se imenujejo odsevi. Rentgenska difrakcija je torej posledica elektromagnetnega valovanja (rentgenskih žarkov), ki naleti na pravilen niz razpršilcev (ponavljajoča se razporeditev atomov v kristalu).
Vhodni žarek (zgoraj levo) povzroči, da vsak razpršilnik (npr. elektron) ponovno odda del svoje energije kot sferični val. Če so atomi razporejeni simetrično z razdaljo d, se ti sferični valovi seštevajo le tam, kjer je razlika v dolžini poti 2d sin θ enaka večkratniku valovne dolžine λ. V tem primeru se v difrakcijskem vzorcu pojavi odbojna točka
Rentgenska analiza kristalov
Kristali so pravilne razpredelnice atomov, kar pomeni, da se atomi vedno znova ponavljajo v vseh treh dimenzijah. Rentgenski žarki so valovi elektromagnetnega sevanja. Ko se rentgenski žarki srečajo z atomi, elektroni v atomih povzročijo, da se rentgenski žarki razpršijo v vse smeri. Ker se rentgenski žarki oddajajo v vse smeri, rentgenski žarek, ki naleti na elektron, povzroči sekundarno sferično valovanje, ki izhaja iz elektrona. Elektron se imenuje razpršilnik. Pravilen niz razpršilcev (v tem primeru ponavljajoči se vzorec atomov v kristalu) ustvarja pravilen niz sferičnih valov. Čeprav se ti valovi v večini smeri med seboj izničijo, se v nekaj posebnih smereh, ki jih določa Braggov zakon, seštevajo:
2 d sin θ = n λ {\displaystyle 2d\sin \theta =n\lambda }
Pri tem je d razmik med difrakcijskimi ravninami, θ {\displaystyle \theta } je vpadni kot, n je poljubno celo število, λ pa je valovna dolžina žarka. Te posebne smeri se pojavijo kot pike na difrakcijskem vzorcu, ki se imenujejo odsevi. Rentgenska difrakcija je torej posledica elektromagnetnega valovanja (rentgenskih žarkov), ki naleti na pravilen niz razpršilcev (ponavljajoča se razporeditev atomov v kristalu).
Vhodni žarek (zgoraj levo) povzroči, da vsak razpršilnik (npr. elektron) ponovno odda del svoje energije kot sferični val. Če so atomi razporejeni simetrično z razdaljo d, se ti sferični valovi seštevajo le tam, kjer je razlika v dolžini poti 2d sin θ enaka večkratniku valovne dolžine λ. V tem primeru se v difrakcijskem vzorcu pojavi odbojna točka
Sorodne strani
Sorodne strani
Vprašanja in odgovori
V: Kaj je rentgenska kristalografija?
O: Rentgenska kristalografija je tehnika, ki se uporablja za prikaz tridimenzionalne strukture molekule, pri kateri se slika na zaslonu ustvari z upogibanjem rentgenskih žarkov iz elektronskega oblaka atoma.
V: Ali se rentgenska kristalografija lahko uporablja za organske in anorganske molekule?
O: Da, rentgensko kristalografijo je mogoče uporabiti za preučevanje organskih in anorganskih molekul.
V: Kdo so izumitelji rentgenske kristalografije?
O: Sir William Bragg in njegov sin sir Lawrence Bragg sta skupaj izumila rentgensko kristalografijo in za svoje odkritje leta 1915 prejela Nobelovo nagrado za fiziko.
V: Katera je najstarejša metoda rentgenske kristalografije?
O: Najstarejša metoda rentgenske kristalografije je rentgenska difrakcija (XRD), pri kateri se z rentgenskimi žarki, ki se sprožijo v posamezen kristal, ustvari vzorec, s katerim je mogoče določiti razporeditev atomov v kristalu.
V: Ali je bil vzorec med postopkom rentgenske kristalografije uničen?
O: Ne, vzorec se med postopkom rentgenske kristalografije ne uniči.
V: Kdo je bil direktor Cavendishovega laboratorija, ko je bila odkrita struktura DNK?
O: Sir Lawrence Bragg je bil direktor laboratorija Cavendish na Univerzi Cambridge, ko so James D. Watson, Francis Crick, Maurice Wilkins in Rosalind Franklin februarja 1953 odkrili strukturo DNK.
V: Kdo je najmlajši Nobelov nagrajenec za fiziko?
O: Sir Lawrence Bragg je najmlajši Nobelov nagrajenec za fiziko, saj je nagrado prejel leta 1915 za skupno odkritje rentgenske kristalografije s svojim očetom sirom Williamom Braggom.
