Selektivni označevalec (genski marker): odpornost, uporaba in primeri

Vodič o selektivnih označevalcih (genski marker): odpornost proti antibiotikom, uporaba, primeri in praktični nasveti za uspešno transfekcijo v bakterijah in celičnih kulturah.

Selektivni označevalec je poročevalski gen, ki je vnesen v celico skupaj z genskim vložkom. To pomeni, da lahko eksperimentator ugotovi, da je v celici pravi gen, saj je označevalec viden ali zaznan.

Najpogosteje se uporablja za bakterije ali celice v kulturi. Selektivni označevalci kažejo uspešnost transfekcije ali drugega postopka za vnos tuje DNK v celico. To je tehnika pri ciljanju genov in izločanju genov.

Selektivni označevalci so pogosto geni za odpornost proti antibiotikom; bakterije, ki so bile podvržene postopku za vnos tuje DNK, rastejo na gojišču, ki vsebuje antibiotik. Antibiotik uniči celice, ki nimajo odpornega označevalca. Bakterijske kolonije, ki lahko rastejo, so uspešno sprejele in izrazile vneseni genski material.

Alternativa izbirnemu označevalcu je presejalni označevalec, ki raziskovalcu omogoča razlikovanje med želenimi in neželenimi celicami.

Kaj je selektivni označevalec in kako deluje

Selektivni označevalec je gen, ki daje celici ali organizmu benificirano lastnost (najpogosteje odpornost proti določeni kemični spojini ali sposobnost rasti na hranilnem mediju), kar omogoči ločevanje celic, ki so uspešno sprejele vnosni gradnik, od tistih, ki ga niso. V praksi se vzorce obdeluje z izbirnim sredstvom (npr. antibiotikom ali hranilnim pomanjkanjem): celice brez označevalca propadejo, prežijo pa le tiste, ki izražajo označevalni gen.

Vrste selektivnih označevalcev

Običajno ločimo več tipov označevalcev:

• Odpornost proti antibiotikom: najpogostejši tip v bakterijski molekularni biologiji in pri kulturi eukariotskih celic (npr. genes za odpornost na ampicilin, kanamicin/G418, kloramfenikol, tetraciklin, hygromicin, puromycin).
• Hranilni/auxotrofni označevalci: uporabljajo se predvsem pri kvasovkah in rastlinah (npr. URA3, HIS3, LEU2), kjer selekcija temelji na sposobnosti rasti brez dodatnega hranila.
• Metabolični ali toksinski označevalci: vključujejo genske sisteme, ki omogočijo preživetje v prisotnosti neke spojine ali inducirajo smrt tistih brez markerja.
• Reporter (presejalni) označevalci: GFP, luciferaza ali LacZ ne omogočajo neposredno smrti/življenja, ampak omogočajo vizualno ali kemijsko identifikacijo transformantov (uporabno za presejanje).

Uporaba v različnih organizmih

Selektivni označevalci se uporabljajo v:

• Bakterijah: plazmidi z geni odpornosti (npr. bla za ampicilin, nptII za kanamicin/G418, cat za kloramfenikol, tetA za tetraciklin).
• Kvasovkah: hranilni markerji (URA3, HIS3, LEU2) ali odpornostni markerji.
• Rastlinah: markerji, kot sta bar (odpornost na glufosinat/bialafos) ali nptII, se pogosto uporabljajo pri Agrobacterium-facilitirani transformaciji.
• Mamalskih celicah: selekcija s sredstvi, kot so G418 (neomycin/neo), hygromycin (hph), puromycin (pac), blasticidin.

Praktični vidiki selekcije

Pri uporabi selektivnih označevalcev je treba upoštevati nekaj praktičnih korakov:

• Optimizacija koncentracije izbirnega sredstva (npr. antibiotika) za dotični sev/celico — previsoka koncentracija ubije tudi transformante, prenizka pa omogoči preživetje negativnih kontrol.
• Uporaba kontrol: gojenje vzorcev na neizbirnem in izbirnem mediju hkrati, da se oceni učinkovitost transformacije in izbiranja.
• Večstopenjska selekcija: pri integraciji v genom se pogosto uporablja potrditvena selekcija in nato molekularna analiza (PCR,sekvenciranje) za preverjanje pravilne integracije.
• Co-transformacija in ko-selekcija: včasih je označevalec na ločenem plazmidu, vendar se izberejo celice, ki so sočasno sprejele želeni vložek in marker.

Odstranjevanje markerjev in marker-free strategije

Ker prisotnost označevalnih genov v končnih produktih (npr. gensko spremenjenih rastlinah) predstavlja regulativne in varnostne pomisleke, so razvite metode za odstranitev markerjev po postopku selekcije:

• Rekombinacijski sistemi: Cre-lox in FLP-FRT omogočata odstranitev izbirnega markerja po integraciji z uporabo rekombinaz.
• Marker-free transformacija: strategije, kjer se uporabljata selekcija s transientno izraženimi markerji ali sinergija z alternativnimi presejalnimi sistemi, da v končnem organizmu marker ni prisoten.
• Uporaba presejalnih/reporterskih markerjev: npr. GFP ali luciferaza za izolacijo transformantov brez uvedbe trajnih odpornostnih genov.

Varnost, etika in regulacija

Uporaba genov za odpornost proti antibiotikom ima biosigurnosne in regulativne implikacije. Pomembno je:

• upoštevati lokalne in mednarodne smernice za uporabo antibiotikov in genske manipulacije,
• izogibati se nepotrebni uporabi markerjev, ki bi lahko prispevali k širjenju odpornosti,
• uporabljati markerje z zrelimi in sprejetimi protokoli ter, kadar je mogoče, metode za kasnejšo odstranitev markerja.

Praktični primeri in nasveti

Pri načrtovanju eksperimenta preverite, kateri markerji so primerni za vaš organizem in protokol. Pri bakterijah in enostavnih vektorjih je uporaba klasičnih genov za odpornost hitra in robustna. Pri kompleksnejših sistemih (rastline, sesalci) razmislite o marker-removal pristopih ali presejalnih reporterjih za zmanjšanje regulativnih ovir.

Primeri izbirnih označevalcev vključujejo:

• bla (ampR) — odpornost proti ampicilinu (pogosto v bakterijskih plazmidih)
• nptII (neo) — odpornost proti kanamicinu / G418 (bakterije, rastline, mamalske celice)
• cat — kloramfenikol acetiltransferaza, odpornost proti kloramfenikolu
• tetA / tetR — odpornost proti tetraciklinu
• hph — odpornost proti hygromicinu (pogosto pri mamalskih celicah)
• pac (puroR) — odpornost proti puromicinu
• bar — odporen na glufosinat/bialafos (uporablja se pri rastlinah)
• URA3, HIS3, LEU2 — auxotrofni markerji pri kvasovkah
• GFP, luciferaza, LacZ — presejalni reporterji za vizualno ali kemijsko identifikacijo transformantov

S pravilno izbiro označevalca in skrbno optimizacijo pogojev selekcije lahko znatno izboljšate uspešnost identifikacije in izolacije želenih transformantov, obenem pa zmanjšate tveganja, povezana z uporabo odpornih markerjev.

Vprašanja in odgovori

V: Kaj je izbirni označevalnik?

V: Za katere vrste celic se najpogosteje uporablja izbirni označevalec?

V: Kakšen je namen izbirnih označevalcev?

V: Pri kateri tehniki se uporabljajo izbirni označevalci?

V: Kateri so primeri izbirnih označevalcev?

V: Kako deluje gen za odpornost proti antibiotikom kot izbirni označevalec?

V: Kaj je alternativa izbirnemu označevalcu?

Išči po črki