Izločanje genov (KO/knockout): definicija, metode in uporaba v raziskavah

Izločanje genov je genetska tehnika, pri kateri se eden od genov organizma trajno onemogoči (izklopi) ali zamenja z nefunkcionalno različico. Namen izločanja je preučiti vlogo določenega gena z opazovanjem sprememb v fenotipu, biokemiji ali razvoju organizma, ko tega gena ni. Ta postopek se pogosto označuje s kratico KO (ang. knockout).

Zakaj in kdaj se uporablja izločanje genov

Organizmi, kot so miši s knockoutom, so temeljni orodji v biomedicinskih raziskavah. Uporabljajo se za:

  • raziskovanje funkcije gena, ki je bil zaporedoma odkrit, vendar njegova funkcija ni znana ali je nepopolno znana;
  • modeliranje človeških bolezni (npr. genetskih motenj, rakavih bolezni, nevrodegenerativnih obolenj);
  • preverjanje, ali je gen primeren kot tarča za razvoj zdravil (target validation);
  • razumevanje genskih interakcij in razvojnih poti;
  • kmetijske in biotehnološke aplikacije, npr. izboljšave rastlin ali gospodarskih živali.

Raziskovalci sklepajo o vlogi izločenega gena z analizo razlik med izločenim organizmom in normalnimi posamezniki; opazujejo lahko vedenje, fiziologijo, podatke iz molekularnih preiskav ali odziv na zdravila.

Glavne metode za ustvarjanje knockoutov (pregled, ne-protokol)

Metode za izločanje genov se razlikujejo glede na organizem, vrsto celic in želeni rezultat. Pomembno je razumeti osnovne koncepte brez detajlnih navodil:

  • Homologna rekombinacija v zarodnih matičnih celicah: klasična pot, ki se je dolgo uporabljala pri mišjih modelih za vstavitev nefunkcionalne allelne različice v genom; omogoča trajne spremembe in generacijsko prenosljiv KO.
  • Endonukleaze za ciljno rezanje DNA: vključujejo tehnologije, kot so TALENs in zinc-finger nukleaze, ter sodobnejši sistem CRISPR–Cas (npr. CRISPR–Cas9) — vse te metode povzročijo zlom v DNA na izbranem mestu, kar vodi do napak pri popravljanju in posledične izgube funkcije gena.
  • Ustvarjanje KO v zarodkih: z urejanjem genomov v oplojenih jajčnih celicah ali zgodnjih zarodkih lahko nastanejo živali z izločenim genom v vseh tkivih (germline KO).
  • Pogojni (conditional) knockouts: sistemi, kot je Cre–loxP, omogočajo izločanje gena le v določenih tkivih ali v določenem času razvoja, kar je koristno pri genih, katerih popolna izguba vodi v zgodnjo smrt zarodka.
  • Inducibilni sistemi: s kemično ali genetsko induciranimi sistemi lahko znanstveniki vključujejo časovno nadzorovano izključitev gena, da preučijo funkcije v odraslih organizmih ali po specifičnih dogodkih.

Razlike med izločanjem genov in drugimi pristopi

Pomembno je razlikovati med:

  • knockout (KO) — trajna izguba funkcije gena, običajno na nivoju DNK;
  • knockdown (npr. z RNAi ali shRNA) — začasno ali delno zmanjšanje izražanja gena na nivoju RNA;
  • knock-in — nasprotni izraz izločanju: pri tem se vgen vloži ali zamenja z delujočo različico (vstavljanje novega ali popravljanje obstoječega alela).

Prednosti, omejitve in tehnični izzivi

Izločanje genov je zelo koristno, vendar ni brez omejitev:

  • Redundanca genov: včasih drugi geni kompenzirajo izgubo, zato fenotipa morda ni ali pa je bolj subtilen;
  • Off-target učinki: pri nekaterih metodah (zlasti pri urejanju genomov) so lahko nenamerne spremembe na drugih mestih v genomu, kar zahteva skrbno validacijo;
  • Mozaičnost: pri urejanju zgodnjih zarodkov lahko pride do mozaiknosti (mešanih celic z različnimi genotipi) v posameznem organizmu;
  • Embrionalna ali perinatalna letalnost: izločitev ključnega gena lahko povzroči zgodnjo smrt, zato so potrebni pogojni pristopi;
  • Interpretacija fenotipa: spremembe so lahko posledica razvojnih adaptacij, ne zgolj neposredne vloge gena.

Validacija in etični vidiki

Poleg molekularne potrditve spremembe v genomu je treba fenotip natančno ovrednotiti, pogosto z uporabo več neodvisnih KO linij ali z komplementacijskimi eksperimenti (npr. dodajanje delujočega gena nazaj). Uporaba živalskih modelov zahteva etično presojo, spoštovanje dobrega počutja živali in skladnost z zakonodajo ter smernicami za zmanjševanje, izboljševanje in nadomeščanje (3R).

Primeri uporabe

Knockout modeli so prispevali k odkritjem številnih bioloških mehanizmov in patofizioloških procesov, na primer preučevanje tumor-supresornega gena p53, genov, povezanih z imunskim sistemom, ter genov, ki vplivajo na presnovo in nevrološke funkcije. Poleg osnovnih raziskav se modele uporablja tudi pri farmakoloških testiranjih in pri preizkušanju novih terapevtskih pristopov.

Nasprotni izraz je genski knock-in. Pri tem se vklopi gen ali vstavi delujoči gen.

Metoda

Knockout se doseže s kombinacijo tehnik. Začne se v epruveti s plazmidom ali drugim DNK-konstruktom in nadaljuje v celični kulturi.

Posamezne celice se gensko preoblikujejo s konstruktom DNK. Pogosto je cilj ustvariti žival s spremenjenim genom.

Če je tako, se embrionalne matične celice gensko preoblikujejo in vstavijo v zgodnje zarodke. Živali z gensko spremembo v zarodnih celicah, ki nastanejo pri tem, lahko pogosto prenesejo izločitev gena na prihodnje generacije.

Vprašanja in odgovori

V: Kaj je izločitev genov?


O: Izločitev genov je genetska tehnika, pri kateri se eden od genov organizma izklopi ali nadomesti z genom, ki ne deluje.

V: Zakaj se uporabljajo izločene miši?


O: Izključene miši se uporabljajo za spoznavanje gena, ki je bil zaporedoma določen, vendar njegova funkcija ni znana ali je nepopolno znana.

V: Na kaj lahko raziskovalci sklepajo iz razlike med izločenimi organizmi in normalnimi posamezniki?


O: Raziskovalci lahko sklepajo na podlagi razlike med izločenim organizmom in normalnimi posamezniki.

V: Kakšna je okrajšava za knockout?


O: Okrajšava za knockout je KO.

V: Kaj je genski knock-in?


O: Genski knock-in je nasprotje genskega izločanja, pri katerem se vklopi gen ali vstavi delujoči gen.

V: V čem se genski knock-in razlikuje od genskega knockouta?


O: Genski knock-in je nasprotje genskega izločanja; medtem ko se genski knockout izklopi ali zamenja gen, ki ne deluje, genski knock-in vstavi delujoč gen.

V: Kakšen je namen uporabe tehnik knockout ali knock-in?


O: Namen uporabe tehnik knockout ali knock-in je izvedeti več o delovanju genov, ki so bili zaporedoma določeni, vendar niso povsem razumljeni.

AlegsaOnline.com - 2020 / 2025 - License CC3