Urejanje genoma: definicija, metode in primeri (CRISPR, ZFN, siRNA)

Urejanje genoma: definicija, metode in primeri (CRISPR, ZFN, siRNA) — kako deluje, prednosti, omejitve in uporaba v raziskavah ter biomedicini.

Urejanje genoma je vrsta genskega inženiringa.

DNK se v genom vstavi, zamenja ali odstrani z umetno ustvarjenimi nukleazami ali "molekularnimi škarjami". Nukleaze na želenih mestih v genomu naredijo specifične prekinitve dvojne verige (DSB). Celica z lastnimi mehanizmi popravi povzročene prekinitve z naravnimi procesi.

Trenutno se uporabljajo štiri družine inženirskih nukleaz.

Kako deluje urejanje genoma

Osnovni princip je ciljno povzročanje poškodb DNA (najpogosteje dvojne verige). Poškodbe nato popravijo celični mehanizmi, kar omogoči trajno spremembo zaporedja:

• NHEJ (non-homologous end joining) – hitri, nestanovitni mehanizem popravljanja, ki pogosto vodi do vstavljanj ali izbrisov (indel), kar lahko povzroči izpad funkcije gena.
• HDR (homology-directed repair) – natančnejši popravek, ki zahteva predlogo (donorsko DNA) in omogoča vstavljanje ali zamenjavo določenega zaporedja; učinkovitost HDR je odvisna od faze celičnega cikla in je pri mnogih celicah nizka.

Glavne metode in tehnologije

Obstajajo različne razširjene in nove tehnologije za ciljanje genomskih lokusov:

• Urejanje genoma z nukleazami, kot je ZFN. To se razlikuje od siRNA. Izbrana nukleaza (encim, ki reže DNK) lahko spremeni vezavo na DNK. Zato lahko načeloma reže katero koli ciljno mesto v genomu in spremeni zaporedja genov, ki jih ni mogoče ciljno usmeriti z običajnim RNAi.
• TALEN (transcription activator‑like effector nucleases) – proteinsko usmerjene nukleaze, ki jih je mogoče programirati za prepoznavanje specifičnih zaporedij DNA.
• CRISPR‑Cas sistemi – najpogosteje uporabljena metoda, ki uporablja kratko vodilno RNA (gRNA) za natančno usmerjanje endonukleaze (npr. Cas9) na ciljno mesto. CRISPR je enostaven za programiranje, prilagodljiv in učinkovit v številnih vrstah celic in organizmov.
• Meganukleaze (homing endonucleases) – naravne ali inženirsko spremenjene nukleaze z dolgim prepoznavnim zaporedjem, primerne za zelo specifična cilja.
• Bazično urejanje (base editing) – metode, ki omogočajo pretvorbo posameznih nukleotidov (npr. C→T ali A→G) brez povzročanja dvojne pretrganine verige DNA.
• Prime editing – novejši pristop, ki omogoča vstavitve, zamenjave in izbrise z manj odvisnosti od HDR in brez klasičnih DSB v mnogih primerih.
• utišanje želenega gena s kratko interferenco RNA (siRNA). Vendar je lahko prekinitev gena s siRNA spremenljiva in nepopolna.

Dostava urejevalcev v celico

Učinkovitost urejanja je močno odvisna od načina dostave uredilcev v ciljne celice:

• viralni vektorji (AAV, lentivirus) – dobro za dolgotrajno izražanje; AAV je priljubljen za somatske terapije;
• nezavirni načini (lipidne nanodelce, lipidne nanopartikle) – uporabne za RNA/encim dostavo brez vključenosti virusov;
• elektroporacija, mikroinjekcija, biočrpalke – za ex vivo urejanje celic ali za modelne organizme;
• Ribonukleoproteinske komplekse (RNP) – vnos Cas beljakovine skupaj z gRNA zmanjšuje trajanje izpostavljenosti in s tem tveganje neželenih učinkov.

Uporabe in primeri

Urejanje genoma ima širok spekter aplikacij:

• temeljne raziskave: hitra priprava genetskih modelov, identifikacija funkcij genov;
• medicinske aplikacije: razvoj somatskih genskih terapij (npr. za dedne krvne bolezni, nekatere očesne bolezni), ex vivo urejanje pacientovih celic (hematopoetske matične celice, T‑celice);
• kmetijstvo: ustvarjanje rastlin in živali z izboljšanimi lastnostmi (odpornost proti boleznim, izboljšana hranilna vrednost, manjše porumenelosti) – nekatere države razlikujejo med gensko spremenjenimi organizmi in produkti, ki so nastali z urejanjem genoma;
• bioinženiring: sinteza novih bioloških sistemov, proizvodnja zdravil in encimov;
• kontroverzni pristopi: genski pogoni (gene drives) za spreminjanje populacij škodljivcev, ki prinašajo velike etične in ekološke izzive.

Varnost, omejitve in etični vidiki

Urejanje genoma prinaša tudi tveganja in omejitve:

• neželeni učinki (off‑target) – nehoteno urejanje na podobnih zaporedjih, kar lahko povzroči neželene mutacije;
• mozaicizem – pri urejanju zarodkov ali zgodnjih razvojnih stadijih lahko pride do heterogenih sprememb v različnih celicah;
• omejena učinkovitost HDR – natančne zamenjave so pri mnogih celicah težje dosegljive;
• etična vprašanja – germline urejanje (trajne spremembe, ki se prenašajo na potomce) je v večini držav strogo regulirano ali prepovedano; javne in strokovne debate se osredotočajo na varnost, pravičnost in regulacijo dostopa;
• pravna regulacija in nadzor kliničnih poskusov sta nujna za varno uporabo v medicini in kmetijstvu.

Urejanje genoma je revija Nature Methods izbrala za metodo leta 2011. Tehnika se že uporablja, vendar vsaditev spremenjenih zarodkov v žensko še ni dovoljena v večini jurisdikcij in ostaja predmet strogih etičnih smernic.

Prihodnost

Tehnologije, kot so natančnejši sistemi za zmanjšanje off‑target učinkov, bazično in prime urejanje ter boljši načini dostave, obetajo varnejše in bolj učinkovite terapije. Hkrati se razvijajo mednarodni etični standardi in regulacije, ki bodo usmerile odgovorno uporabo teh tehnologij v medicini, kmetijstvu in raziskavah.

Vprašanja in odgovori

V: Kaj je urejanje genoma?

V: Kako se umetne nukleaze uporabljajo pri urejanju genoma?

V: Kateri so primeri posrednih metod, ki se uporabljajo za razumevanje delovanja genov?

V: Zakaj je bilo urejanje genoma izbrano za metodo leta 2011 v reviji Nature Methods?

V: Ali obstajajo različne vrste inženirskih nukleaz, ki se lahko uporabljajo za urejanje genoma?

V: Kako se siRNA razlikuje od drugih metod za razumevanje delovanja genov?

V: Ali je vsaditev modificiranih zarodkov v žensko trenutno dovoljena?

Išči po črki