Cinkove prstne nukleaze (ZFN): opis in vloga pri urejanju genoma
Cinkove prstne nukleaze (ZFN): jasen opis delovanja, uporabe in vloge pri natančnem urejanju genoma — princip, ciljanje genov, posledice in etični vidiki.
Nukleaze s cinkovimi prsti (ali ZFN) so orodje, ki se uporablja za ciljanje genov in spreminjanje DNK. To je ena od treh metod spreminjanja genoma z inženirskimi nukleazami in je bila eno izmed prvih praktičnih pristopov za selektivno sekanje DNK v celicah.
Imajo dva dela. Cinkovi prsti so umetne molekule, sestavljene iz beljakovine in cinka; vsaka domena cinkovega prsta prepozna in se veže na kratek nukleotidni niz. Nukleaze s cinkovim prstom (ZFN) so encimi, pridobljeni z združitvijo cinkovega prsta z encimom za cepljenje DNK, imenovanim FokI. Tako se ZFN veže na določeno zaporedje DNK na obeh verigah in FokI, ki deluje kot nukleaza, nato odreže obeh verigi DNK na natančno definiranem mestu. Po tvorbi dvojnih loma celica uporabi lastne mehanizme popravljanja, ki pogosto vključujejo nehomologne združitve (NHEJ) ali pa, če je na voljo templar, homologne rekombinacije (HDR) — v obeh primerih gre za procese, ki spadajo pod širši pojem popravljanje DNK.
Možna izida rezov in posledice za gen
Ko pride do preže v DNK, so najpogostejši rezultati:
- NHEJ — celica hitro zlepi konce, kar pogosto vodi do majhnih delecion ali insercij (mutacij), ki lahko povzročijo izgubo funkcije gena.
- HDR — če je prisoten ustrezen popravljalni templar (donorska sekvenca), lahko celica vključi to zaporedje in tako natančno vstavi ali popravi želeno spremembo.
Specifičnost, načrtovanje in omejitve
Vsak ZFN je običajno zasnovan za en gen ali celo za eno posebno mesto v genu, imenovanega "ciljni gen" ali "ciljna DNK". Zasnova cinkovih prstov zahteva poznavanje zaporedja tarče in pogosto precejžen laboratorijski in računalniški napor, saj morajo posamezni prsti natančno prepoznati specifične triplete ali kratke nize baz. V praksi so glavni izzivi:
- možnost off-target rezov (sekvence, podobne cilju);
- težavnost načrtovanja in izdelave učinkovitih domen cinkovih prstov;
- odvisnost rezultata od izbranega celičnega mehanizma popravljanja (NHEJ vs. HDR).
Uporaba v raziskavah in terapiji
ZFN so bili široko uporabljeni v genetiki in molekularni biologiji za:
- pridobivanje gensko spremenjenih modelov (miši, celične linije, rastline) za raziskave funkcije genov;
- izklop gena (knockout) z namenom proučevanja njegove funkcije;
- ciljno vstavljanje ali popravljanje delečih zaporedij v kombinaciji z donor-DNK;
- raziskave potencialnih genskih terapij — primeri kliničnih študij so poskušali uporabiti ZFN za motnje, kjer izklop ali poprava specifičnega gena lahko prinese terapevtski učinek.
Prednosti in slabosti v primerjavi z drugimi metodami
ZFN imajo prednosti v smislu, da lahko ob pravilni zasnovi delujejo zelo specifično in z zanesljivimi rezultati. Vendar pa so kompleksnost njihovega načrtovanja in izdelave ter potencial za off-target učinke omejitve v primerjavi z novejšimi orodji, kot so TALEN in predvsem CRISPR/Cas sistemi, ki nudijo lažjo prilagodljivost in enostavnejšo proizvodnjo vodilnih molekul za različne cilje.
Dostava v celice in varnost
Za delovanje ZFN jih je treba vnesti v celice; običajne metode vključujejo transfekcijo, elektroporacijo, vektorske sisteme (npr. adenovirusne ali lentivirusne vektorje) ali nanodelce. Za klinične aplikacije je ključna varnost: treba je zmanjšati imunske odzive, off-target rezove in neželene posledice popravljanja DNK. Varnostne študije in regulativni pregledi so zato obvezni del razvoja terapevtskih pristopov z ZFN.
Etična in regulativna vprašanja
Ker ZFN trajno spreminjajo genom celic, so z njimi povezana etična vprašanja predvsem, kadar gre za zarodne spremembe ali za spremembe, ki bi se prenašale na potomce. Regulatorne zahteve se razlikujejo med državami, a splošno načelo je previdnost: klinične aplikacije morajo izkazati jasne varnostne in učinkovitostne dokaze, zlasti pri posegih v človeške bolnike.
Zaključek
ZFN predstavljajo pomembno stopnjo v razvoju orodij za urejanje genoma: omogočajo ciljno sekanje DNK in s tem ustvarjanje mutacij ali natančnih popravkov. Čeprav so v zadnjem desetletju delno nadomeščeni z enostavnejšimi in prilagodljivejšimi sistemi, še vedno ostajajo uporabna in zgodovinsko pomembna tehnologija v molekularni biologiji, z jasno vlogo v raziskavah funkcije genov in pri nekaterih terapevtskih pristopih.
Opombe za nadaljnje branje: za praktične rezultate popravljanja lahko preberete več o procesu popravljanje DNK, o načinih ciljanega genetskega raziskovanja pa viri, ki primerjajo različne tehnologije za urejanje genoma (ZFN, TALEN, CRISPR).


Tridimenzionalni prikaz molekule cinkovega prsta. Cinkovi prsti so označeni modro, cinkov ion pa zeleno.
Struktura cinkovega prsta
"Cinkov prst" je ime za številne beljakovinske strukture. Atom cinka veže beljakovine in jih naredi stabilnejše. ZFN se vežejo na bazne pare DNK. En cinkov prst lahko sam veže približno 3 bazne pare.
Funkcija ZFN
Nukleaze s cinkovimi prsti imajo 3-6 cinkovih prstov. ZFN imajo dve pomembni domeni: domeno, ki veže DNK, in domeno, ki cepi DNK. Domena za cepljenje DNK uporablja encim, imenovan Fokl, ki lomi DNK.
ZFN lahko spremenijo le zaporedja DNK, za katera so zasnovani. Domena za vezavo DNK se veže na določeno zaporedje DNK. Dva ZFN, zasnovana za isto zaporedje DNK, morata spremeniti en gen. Domene, ki se vežejo na DNK, se vežejo na obe verigi v dvojni vijačnici DNK. Domene, ki cepijo DNK, pretrgajo verigo DNK in izrežejo pare baz gena. Celice same popravijo pretrgane verige DNK s popravljanjem DNK. Delecijske mutacije nastanejo zaradi manjkajočih baznih parov po popravilu DNK.
Določite lahko tudi dolžino ciljnega genskega zaporedja. S tremi cinkovimi prsti je mogoče spremeniti najmanj 9 baznih parov. To je uporabno za odstranjevanje in vstavljanje zelo kratkih zaporedij DNK ter ugotavljanje njihovega vpliva na ciljni gen. Tudi velika zaporedja je mogoče spremeniti z uporabo več kot enega ZFN.
Uporaba ZFN
ZFN so bili uporabljeni za odkrivanje funkcij genov v številnih genetskih študijah. ZFN se lahko uporabljajo za spreminjanje DNK pri vseh vrstah. Druga značilnost ZFN je, da jih je mogoče uporabljati in vivo (v živih organizmih). Trenutno se uporabljajo na modelnih organizmih: rastlinah, žuželkah in ribah.
Seznam organizmov, vključenih v raziskave spreminjanja genov ZFN, vključuje:
- Arabidopsis
- Govedo
- C. elegans
- Koruza
- Drosophila melanogaster
- Žabe
- Miši
- Prašiči
- Zajci
- Podgane
- Morski ježki
- Sviloprejke
- Soja
- Tobak
- Zebrafish
Težave pri uporabi ZFN
Največja težava pri ZFN je, da poleg ciljnega gena po naključju spremenijo tudi druge gene. ZFN je treba izdelati tako, da na ciljnem genu najde prave bazne pare. Ti bazni pari so izbrani tako, da jih ima samo ciljni gen. Domene za razgradnjo DNK delujejo na katerem koli zaporedju DNK, zato bo vezava na napačno zaporedje gena namesto tega spremenila to zaporedje. ZFN, ki izločijo bazne pare za več kot en gen, se ne štejejo za natančne.
Vprašanja in odgovori
V: Kaj so nukleaze s cinkovimi prsti ali ZFN?
O: Nukleaze s cinkovimi prsti ali ZFN so orodje, ki se uporablja za ciljanje genov in spreminjanje DNK.
V: Kateri so trije načini spreminjanja genoma z inženirskimi nukleazami?
O: Nukleaze s cinkovimi prsti ali ZFN, nukleaze TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nucleases) in CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) so tri metode spreminjanja genoma s pomočjo inženirskih nukleaz.
V: Kaj so cinkovi prsti?
O: Cinkovi prsti so umetne molekule iz beljakovine in cinka, ki se vežejo na določeno DNK.
V: Kaj so nukleaze s cinkovimi prsti (ZFN)?
O: Nukleaze s cinkovimi prsti (ZFN) so encimi, ki nastanejo z združitvijo cinkovega prsta z encimom za cepljenje DNK, imenovanim Fokl.
V: Kaj se zgodi, ko se ZFN veže na določeno zaporedje DNK?
O: Ko se ZFN veže na določeno zaporedje DNK, ga odreže na dveh mestih.
V: Kaj naredijo običajni celični encimi, ko je DNK odrezana?
O: Običajni celični encimi zlepijo konce skupaj, brez izrezanega dela (popravilo DNK).
V: Kateri sta dve vrsti sprememb DNK, ki jih lahko naredijo nukleaze s cinkovimi prsti ali ZFN?
O: Nukleaze s cinkovimi prsti ali ZFN lahko naredijo dve vrsti sprememb DNK: mutacije, kot so delecije in insercije.
Iskati