Nukleaze s cinkovimi prsti
Nukleaze s cinkovimi prsti (ali ZFN) so orodje, ki se uporablja za ciljanje genov in spreminjanje DNK. To je ena od treh metod spreminjanja genoma z inženirskimi nukleazami.
Imajo dva dela. Cinkovi prsti so umetne molekule, sestavljene iz beljakovine in cinka. Vsaka se veže na določeno DNK. Nukleaze s cinkovim prstom (ZFN) so encimi, pridobljeni z združitvijo cinkovega prsta z encimom za cepljenje DNK, imenovanim Fokl. Tako se ZFN veže na določeno zaporedje DNK in ga nato odreže na dveh mestih. Običajni celični encimi zlepijo konca skupaj, brez izrezanega dela (popravljanje DNK).
Vsak ZFN je narejen za uporabo na enem genu, ki se imenuje "ciljni gen" ali "ciljna DNK". Zasnovati jih je mogoče tako, da delujejo na določenih delih genov in ustvarijo želeno spremembo. Dve vrsti sprememb DNK sta mutacije, kot so delecije in insercije. Genetske raziskave preučujejo mutirane živalske subjekte, da bi ugotovili, kaj določen gen počne.
Tridimenzionalni prikaz molekule cinkovega prsta. Cinkovi prsti so označeni modro, cinkov ion pa zeleno.
Struktura cinkovega prsta
"Cinkov prst" je ime za številne beljakovinske strukture. Atom cinka veže beljakovine in jih naredi stabilnejše. ZFN se vežejo na bazne pare DNK. En cinkov prst lahko sam veže približno 3 bazne pare.
Funkcija ZFN
Nukleaze s cinkovimi prsti imajo 3-6 cinkovih prstov. ZFN imajo dve pomembni domeni: domeno, ki veže DNK, in domeno, ki cepi DNK. Domena za cepljenje DNK uporablja encim, imenovan Fokl, ki lomi DNK.
ZFN lahko spremenijo le zaporedja DNK, za katera so zasnovani. Domena za vezavo DNK se veže na določeno zaporedje DNK. Dva ZFN, zasnovana za isto zaporedje DNK, morata spremeniti en gen. Domene, ki se vežejo na DNK, se vežejo na obe verigi v dvojni vijačnici DNK. Domene, ki cepijo DNK, pretrgajo verigo DNK in izrežejo pare baz gena. Celice same popravijo pretrgane verige DNK s popravljanjem DNK. Delecijske mutacije nastanejo zaradi manjkajočih baznih parov po popravilu DNK.
Določite lahko tudi dolžino ciljnega genskega zaporedja. S tremi cinkovimi prsti je mogoče spremeniti najmanj 9 baznih parov. To je uporabno za odstranjevanje in vstavljanje zelo kratkih zaporedij DNK ter ugotavljanje njihovega vpliva na ciljni gen. Tudi velika zaporedja je mogoče spremeniti z uporabo več kot enega ZFN.
Uporaba ZFN
ZFN so bili uporabljeni za odkrivanje funkcij genov v številnih genetskih študijah. ZFN se lahko uporabljajo za spreminjanje DNK pri vseh vrstah. Druga značilnost ZFN je, da jih je mogoče uporabljati in vivo (v živih organizmih). Trenutno se uporabljajo na modelnih organizmih: rastlinah, žuželkah in ribah.
Seznam organizmov, vključenih v raziskave spreminjanja genov ZFN, vključuje:
- Arabidopsis
- Govedo
- C. elegans
- Koruza
- Drosophila melanogaster
- Žabe
- Miši
- Prašiči
- Zajci
- Podgane
- Morski ježki
- Sviloprejke
- Soja
- Tobak
- Zebrafish
Težave pri uporabi ZFN
Največja težava pri ZFN je, da poleg ciljnega gena po naključju spremenijo tudi druge gene. ZFN je treba izdelati tako, da na ciljnem genu najde prave bazne pare. Ti bazni pari so izbrani tako, da jih ima samo ciljni gen. Domene za razgradnjo DNK delujejo na katerem koli zaporedju DNK, zato bo vezava na napačno zaporedje gena namesto tega spremenila to zaporedje. ZFN, ki izločijo bazne pare za več kot en gen, se ne štejejo za natančne.
Vprašanja in odgovori
V: Kaj so nukleaze s cinkovimi prsti ali ZFN?
O: Nukleaze s cinkovimi prsti ali ZFN so orodje, ki se uporablja za ciljanje genov in spreminjanje DNK.
V: Kateri so trije načini spreminjanja genoma z inženirskimi nukleazami?
O: Nukleaze s cinkovimi prsti ali ZFN, nukleaze TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nucleases) in CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) so tri metode spreminjanja genoma s pomočjo inženirskih nukleaz.
V: Kaj so cinkovi prsti?
O: Cinkovi prsti so umetne molekule iz beljakovine in cinka, ki se vežejo na določeno DNK.
V: Kaj so nukleaze s cinkovimi prsti (ZFN)?
O: Nukleaze s cinkovimi prsti (ZFN) so encimi, ki nastanejo z združitvijo cinkovega prsta z encimom za cepljenje DNK, imenovanim Fokl.
V: Kaj se zgodi, ko se ZFN veže na določeno zaporedje DNK?
O: Ko se ZFN veže na določeno zaporedje DNK, ga odreže na dveh mestih.
V: Kaj naredijo običajni celični encimi, ko je DNK odrezana?
O: Običajni celični encimi zlepijo konce skupaj, brez izrezanega dela (popravilo DNK).
V: Kateri sta dve vrsti sprememb DNK, ki jih lahko naredijo nukleaze s cinkovimi prsti ali ZFN?
O: Nukleaze s cinkovimi prsti ali ZFN lahko naredijo dve vrsti sprememb DNK: mutacije, kot so delecije in insercije.
