Interferenca RNA (RNAi): definicija, mehanizem, miRNA in siRNA

Interferenca RNA (RNAi): definicija, mehanizem delovanja, vloga miRNA in siRNA, obramba pred virusi ter uporabe v raziskavah, biotehnologiji in medicini.

Interferenca RNA (RNAi) je proces v živih celicah. Prilagaja (umirja) aktivnost njihovih genov. Molekule RNAi so ključne za uravnavanje genov. Leta 2006 sta si Andrew Fire in Craig Mello razdelila Nobelovo nagrado za fiziologijo ali medicino za svoje delo o interferenci RNA pri črvu nematodi Caenorhabditis elegans, objavljeno leta 1998.

Dve vrsti majhnih molekul RNA - mikroRNA (miRNA) in majhna interferenčna RNA (siRNA) - opravljata svoje delo. Te majhne RNA se vežejo na običajne molekule sporočilne RNA (mRNA) in povečajo ali zmanjšajo njihovo aktivnost. Tako lahko preprečijo, da bi mRNA proizvajala beljakovino. Interferenca RNK brani celice pred tujimi nukleotidnimi zaporedji - virusi in transpozoni. Prav tako nadzorujejo razvoj in izražanje genov na splošno.

Pot RNAi je prisotna pri številnih evkariontih, vključno z živalmi. RNAi je dragoceno raziskovalno orodje v celičnih kulturah in živih organizmih. Sintetična dsRNA, vnesena v celice, lahko zavira določene gene, ki nas zanimajo. RNAi se lahko uporablja za obsežne preglede, ki izklopijo vsak gen za analizo celičnega procesa ali celične delitve. Pot se uporablja tudi kot praktično orodje v biotehnologiji in medicini.

Mehanizem delovanja

Osnovni koraki RNAi so podobni pri mnogih evkariontih:

• Prekurzorji: Dolge dvovojne RNA (dsRNA) ali endogeni prekurzorji, kot so pre-miRNA, so začetek procesa.
• Obdelava: Encim Dicer reže dsRNA na kratke duplexe ~20–25 nukleotidov (siRNA ali miRNA duplexa). Pri živalih se miRNA običajno oblikuje iz hairpin-predhodnikov in v jedru najprej obdeluje Drosha, nato pa jih Dicer v citoplazmi dokonča.
• Nalaganje v RISC: Ena veriga duplexa (vodilna ali guide strand) se vključi v kompleks, imenovan RISC (RNA-induced silencing complex), kjer je ključna beljakovina družine Argonaute (AGO). Druga veriga (passenger) se razgradi.
• Ciljanje mRNA: Vodilna RNA vodi RISC do ciljne sporočilne RNA s komplementarnim zaporedjem. Če je ujemanje popolno ali skoraj popolno, AGO lahko neposredno razcepi (cleava) mRNA. Če je ujemanje delno, je pogosto rezultat zaviranje prevajanja in/ali pospešeno razgradnja mRNA.

Razlike med miRNA in siRNA

• Izvor: miRNA so običajno endogene in nastanejo iz prekurzorskih hairpin struktur v genomu. siRNA pa lahko izhajajo iz eksogenih virov (npr. virusi, sintetično vnešene dsRNA) ali iz endogenih dolgih dsRNA (npr. transpozoni).
• Telo delovanja: miRNA običajno delujejo z delnim ujemanjem s ciljno mRNA in nadzorujejo stabilnost ali prevajanje, medtem ko siRNA pri popolnem ujemanju pogosto sprožijo cepitev ciljne mRNA.
• Varnostne razlike: Pri sesalcih dolga eksogena dsRNA v celici sproži tudi interferonski odgovor; zato se v terapevtskem in eksperimentalnem okolju v sesalcih uporabljajo kratki siRNA-duplexi ali shRNA, ki se izogibajo globalni aktivaciji imunskega odgovora.

Vloga v naravi

RNAi ima več bioloških funkcij:

• Antivirusna obramba: Rastline, nekatere živali in žuželke uporabljajo RNAi za prepoznavanje in uničenje virusnih RNA.
• Ukrivljanje transpozonov: RNAi pomaga utišati mobilne genetske elemente (transpozone), kar varuje genom pred mutacijami.
• Razvojna regulacija: miRNA so ključne pri časovni in prostorski regulaciji genov med razvojem tkiv in organov.

Uporaba v raziskavah in medicini

RNAi je postala nepogrešljivo orodje v molekularni biologiji:

• Gene knockdown: Sintetični siRNA ali vektorji za izražanje kratkih hairpin RNA (shRNA) se uporabljajo za začasno ali trajno utišanje genov, da se preuči njihov pomen v celici.
• Visokoprepustni zasloni: RNAi se uporablja v genomskih zaslonih za sistematično ugotavljanje genov, ki sodelujejo v določenih procesih (npr. celični rasti, odzivu na zdravila).
• Terapevtske aplikacije: Obstajajo že zdravila, ki temeljijo na siRNA. Primer je zdravilo proti dedni amiloidozi povzročeni s TTR proteinom (npr. patisiran/ONPATTRO), ki je pokazalo, da je mogoče RNAi uporabiti v klinični praksi. Raziskave pa nadaljujejo z novimi dostavnimi sistemi (lipidne nano delce, GalNAc-konjugate za tarčo v jetrih) in razširjenimi cilji bolezni.

Omejitve in izzivi

• Dostava: Učinkovito usmerjanje siRNA v ciljna tkiva in celice (izven jeter) ostaja izziv.
• Imunska aktivacija: Nekateri nukleotidni motivi ali dolžina dsRNA lahko sprožijo imunni odgovor; zato je kemična modifikacija nujna za varnost in stabilnost.
• Off-target učinki: Delno ujemanje lahko vpliva na nedolžne transkripte; skrbna zasnova in kontrolni eksperimenti so potrebni.
• Trajnost učinka: Utišanje z RNAi je pogosto začasno; za dolgotrajnejše učinke se uporabljajo vektorsko izraženi shRNA ali ponavljajoča se zdravljenje.

Praktični nasveti za uporabo v laboratoriju

• Uporabljajte več neodvisnih siRNA usmerjenih proti istemu genu in primere kontrol (npr. nespecifični siRNA), da potrdite specifičnost.
• Potrdite utišanje na ravni mRNA (qPCR) in beljakovine (Western blot), saj zmanjšanje mRNA ne pomeni vedno sorazmernega zmanjšanja beljakovine.
• Pri delu s sesalčjimi celicami izogibajte dolgi dsRNA; raje uporabite 21–23 nt siRNA ali shRNA sisteme.

RNAi je torej močan naravni mehanizem in uporabno orodje za razumevanje genetike, biologije razvoja in za razvoj novih terapij, vendar zahteva premišljeno načrtovanje zaradi tehnoloških in bioloških izzivov.

Vprašanja in odgovori

V: Kaj je interferenca RNK?

V: Kdo je prejel Nobelovo nagrado za svoje delo na področju interference RNA?

V: Kateri sta dve vrsti majhnih RNK, ki sta vključeni v ta proces?

V: Kako te majhne RNK vplivajo na izražanje genov?

V: Kakšne druge vloge ima RNAi v živih organizmih?

V: Ali obstaja kakšna praktična uporaba te poti?

Išči po črki