Knockout miška: kaj je miška z izklopljenim genom in njena uporaba

Odkrijte, kako knockout miške z izklopljenimi geni razkrivajo funkcije genov, napredek tehnologije, zgodovino in praktične uporabe v biomedicinskih raziskavah.

Izključena miš je gensko spremenjena miš, pri kateri je eden ali več genov izklopljenih z izključitvijo genov.

Izločene miši so pomembni živalski modeli za preučevanje vloge genov, ki so bili zaporedoma določeni, vendar njihova funkcija še ni znana. Raziskovalci lahko sklepajo o verjetni funkciji določenega gena tako, da ga pri miših onesposobijo in opazujejo morebitne razlike od normalnega vedenja ali stanja.

Miši so trenutno najbolj sorodna laboratorijska živalska vrsta človeku, za katero je mogoče zlahka uporabiti tehniko knockouta. Pogosto se uporabljajo v poskusih z izločanjem, zlasti pri genetskih vprašanjih, ki se nanašajo na človeško fiziologijo.

Pri podganah je izločanje genov veliko težje in je mogoče šele od leta 2003.

Mario R. Capecchi, Martin Evans in Oliver Smithies so leta 1989 ustvarili prvo izločeno miš, za kar so leta 2007 prejeli Nobelovo nagrado za fiziologijo ali medicino.

Podrobna razlaga o tem, kako se pridobivajo miši s knockoutom (KO), je na spletni strani Nobelove nagrade za fiziologijo ali medicino 2007.

V mnogih državah so zasebna podjetja patentirala nekatere vidike tehnologije za ustvarjanje miši s knockoutom in same miši.

Kako se pridobivajo knockout miši

Tradicionalna metoda temelji na homologna rekombinaciji v embrionalnih matičnih celicah (ES celice). Postopek na kratko:

• Načrtovanje ciljne konstruktne DNK z izmenjavo ali vnosom selekcijskega markerja v ciljnih regijah gena.
• Vnos konstruktne DNK v in vitro gojene ES celice in izbira celic, kjer je homologna rekombinacija potekala pravilno.
• Vnos spremenjenih ES celic v zarodke (blastociste) in priprava mešanih zarodkov (kimer).
• Vzreja kimer in iskanje potomcev z željeno spremembo v germinalnem ustroju (prenos v zarodno linijo).

Ta proces je bil dolgo standard, vendar je dolgotrajen (mesični dolet) in zahteva specifične ES celice primerne za kmetijo izbrane mišje vrste oziroma sev.

Moderne metode in CRISPR

Sodobne tehnike, zlasti CRISPR/Cas9, so postavile razvoj knockout modelov na novo raven: genetsko spreminjanje je zdaj pogosto hitrejše, cenejše in bolj neposredno (vstavljanje reagentov v oplojeno zarodnico), kar omogoča ustvarjanje KO živali brez vmesne rabe ES celic. CRISPR omogoča tudi generiranje večkratnih genetskih sprememb hkrati in lažje ciljanje v drugih vrstah, npr. pri podganah ali drugih modelnih organizmih.

Vrste knockout miših

• Konstitutivni (stalni) knockout: gen je izklopljen v vseh tkivih skozi celotno življenje organizma.
• Pogojni (conditional) knockout: gen je izklopljen le v določenih tkivih ali ob določenem času, pogosto z uporabo sistemov, kot je Cre-Lox (tkivno specifična promotorja Cre recombinaze) ali inducibilnih oblik Cre (npr. Cre-ER, aktivacija z tamoksifenom).
• Delni ali hypomorfni allele: zmanjšana, ne popolna izguba funkcije; uporabno, kadar popolna izguba povzroči embrionalno smrt.

Uporaba

Knockout miši so temelj v:

• Raziskavah osnovne biologije in funkcije genov.
• Modeliranju človeških bolezni (npr. genetske motnje, rak, nevrodegenerativne bolezni, presnovne motnje).
• Preizkušanju zdravil in odkrivanju tarč za terapije.
• Validaciji biomarkerjev in patofizioloških mehanizmov.

Omejitve in izzivi

• Kompenzacija genov: izguba enega gena lahko sproži spremembe izražanja sorodnih genov, kar zakriva fenotip.
• Embrionalna letalnost: nekateri KO povzročijo zgodnjo smrt, zato so potrebni pogojni pristopi.
• Vpliv genetskega ozadja: različne mišje linije lahko dajejo različne fenotipe; zato so pomembne kontrole, backcross in uporaba littermate kontrol.
• Možne nezaželene tarče (off-target): pri orodjih, kot je CRISPR, se lahko zgodijo nepričakovane spremembe; potrebna je temeljita genotipizacija in potrditev.
• Stroški in dostopnost: licenciranje tehnologij in vzdrževanje modelov lahko povečata stroške raziskav.

Etika, regulacija in patentiranje

Uporaba KO živali je predmet etičnih in pravnih standardov: zahteve so nadzorovane z etičnimi komisijami za delo z živalmi in zakonodajo, ki sledi načelom 3R (zamenjaj, zmanjšaj, izboljšaj). V nekaterih primerih zasebna podjetja patentirajo tehnologije ali specifične linije, kar vpliva na dostopnost, ceno in pogoje za raziskave ter zahteva licence za komercialno uporabo.

Zgodovina in prihodnost

Omenjeni pionirji Mario R. Capecchi, Martin Evans in Oliver Smithies so z razvojem metode homologne rekombinacije v ES celicah omogočili razvoj KO modelov, za kar so prejeli Nobelovo nagrado za fiziologijo ali medicino. Podrobna razlaga postopka je na strani Nobelove nagrade za fiziologijo ali medicino 2007.

Napredek v genskem inženirstvu (npr. CRISPR) nadaljuje širitev možnosti: hitrejše ustvarjanje modelov, lažji multipli cilji in širša uporaba v drugih vrstah. Kljub tehnološkemu napredku pa ostajajo znanstvene, etične in regulativne zahteve, ki oblikujejo, kako se ti modeli uporabljajo v raziskavah in razvojnih programih.

Priporočila za raziskovalce

• Uporabljajte ustrezne kontrole in več neodvisnih linij za potrditev fenotipa.
• Dokumentirajte genetsko ozadje in izvedite backcrossing, če je potrebno.
• Preverite morebitne off-target učinke in naredite molekularno potrditev mutacije.
• Razmislite o pogojnih ali inducibilnih modelih, kadar je to potrebno zaradi letalnosti ali tkivne specifičnosti.
• Spoštujte etične smernice in pridobite ustrezna dovoljenja za delo z živalmi.

Vprašanja in odgovori

V: Kaj je knockout miš?

V: Zakaj so izločene miši pomembne?

V: Katere vrste živali se uporabljajo za poskuse s knockoutom?

V: Kdo je ustvaril prvo izločeno miš?

V: Kje lahko najdem informacije o tem, kako se proizvajajo miši KO?

V: Ali so vidiki tehnologije KO patentirani?

Išči po črki