Usmerjena evolucija
Usmerjena evolucija (DE) je metoda, ki se uporablja za proizvodnjo encimov za industrijske ali medicinske namene.
Metoda je proteinski inženiring, ki posnema naravno selekcijo.
Osnovna zamisel je, da gen večkrat mutacijsko spremenimo in tako ustvarimo knjižnico različic. Izbira izloči gene z želeno funkcijo. Ti so predloga za naslednji krog.
To se lahko izvaja in vivo (v živih celicah bakterij ali kvasovk) ali in vitro (prosto v raztopini ali mikrokapljicah).
S preizkušanjem več mutantov povečate možnost, da boste našli mutanta z želenimi lastnostmi.
Med evolucijo in vivo se vsaka celica (običajno bakterije ali kvasovke) transformira s plazmidom, ki vsebuje različne člane knjižnice variant. Med celicami se razlikuje le gen, ki jih zanima, vsi drugi geni pa ostanejo enaki.
Celice izražajo beljakovino v citoplazmi ali na površini, kjer je mogoče preveriti njeno delovanje. Prednost te oblike je izbira lastnosti v celičnem okolju, kar je koristno, kadar je treba razviti protein ali RNK uporabiti v živih organizmih.
Kadar se DE izvaja brez celic, se za proizvodnjo proteinov ali RNK v raztopini ali v umetnih mikrokapljicah uporablja in vitro transkripcijsko prevajanje. Prednost tega je, da omogoča več pogojev (npr. temperatura, topila). Pri tem se lahko izražajo beljakovine, ki bi bile za celice strupene. Poleg tega lahko pri poskusih razvoja in vitro ustvarimo veliko večje knjižnice (do 1015), saj DNA knjižnice ni treba vstaviti v celice. To pogosto omejuje možnosti, ki jih je mogoče uporabiti.
Primer usmerjene evolucije v primerjavi z naravno evolucijo. Notranji krog prikazuje tri stopnje cikla usmerjene evolucije, v oklepaju pa je posnemani naravni proces. Zunanji krog prikazuje korake v tipičnem poskusu. Rdeči simboli označujejo funkcionalne različice, bledi simboli pa različice z zmanjšano funkcijo
Zagotavljanje dednosti
Ko so izolirani funkcionalni proteini, je nujno, da so izolirani tudi njihovi geni, zato je potrebna povezava med genotipom in fenotipom.
To je lahko kovalentno, ko je gen mRNA na koncu prevajanja s puromicinom povezan z beljakovino.
Druga možnost je, da sta protein in njegov gen skupaj ali v emulzijskih kapljicah. Izolirana genska zaporedja se nato razmnožijo s PCR ali s transformiranimi gostiteljskimi bakterijami. Kot predlogo za naslednji krog mutageneze se lahko uporabi eno samo najboljše zaporedje ali skupina zaporedij. Zaradi ponavljajočih se ciklov diverzifikacija-selekcija-amplifikacija nastanejo encimske variacije, prilagojene selekcijskemu procesu.
Izražena beljakovina je lahko kovalentno povezana s svojim genom (kot mRNA), levo, ali pa je z njim v istem predelu, desno. V vsakem primeru je gen, ki kodira beljakovino, izoliran.
Podeljena nagrada
Ameriška inženirka Frances Arnold je prejela nagrado za tehnologijo tisočletja za pionirsko usmerjeno evolucijo.
Vprašanja in odgovori
V: Kaj je usmerjeni razvoj?
O: Usmerjena evolucija (DE) je metoda, ki se uporablja za proizvodnjo encimov za industrijske ali medicinske namene. Gre za obliko inženiringa proteinov, ki posnema naravno selekcijo.
V: Kako deluje usmerjena evolucija?
O: Usmerjena evolucija deluje tako, da se gen večkrat mutacijsko spreminja, s čimer se ustvari knjižnica različic. Izbor nato izloči gene z želeno funkcijo, ki se nato uporabijo kot predloge za naslednji krog.
V: Kje se lahko izvaja usmerjena evolucija?
O: Usmerjena evolucija se lahko izvaja in vivo (v živih celicah bakterij ali kvasovk) ali in vitro (prosto v raztopini ali mikrokapljicah).
V: Kakšne so prednosti usmerjene evolucije in vivo?
O: Prednost usmerjene evolucije in vivo je izbira lastnosti v celičnem okolju, kar je koristno, kadar je treba razviti protein ali RNK uporabiti v živih organizmih.
V: Katere so prednosti usmerjene evolucije in vitro?
O: Prednost usmerjene evolucije in vitro je, da omogoča več pogojev (npr. temperatura, topila) in lahko izraža beljakovine, ki bi bile za celice strupene. Poleg tega je mogoče ustvariti veliko večje knjižnice, ker DNK ni treba vstaviti v celice.
V: Kaj omejuje možnosti, ki jih je mogoče narediti med poskusom in vitro?
O: Omejitev velikosti tega, kar je mogoče narediti med poskusom in vitro, je pogosto določena s tem, koliko DNK je treba vstaviti v celice.
