ELISA (EIA): definicija, princip in uporaba imunskega testa

Metoda ELISA (Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay) (včasih uporabljena kratica "EIA") je laboratorijska tehnika, uporabljena v biokemiji in molekularni biologiji za odkrivanje in kvantifikacijo specifičnih molekul v vzorcu — na primer določenega citokina ali antigena. Temelji na specifičnem vezanju protiteles, ki prepoznajo tarčno snov, ter na encimsko vezani signali, ki omogočijo merjenje prisotnosti in količine tarče.

Princip delovanja

Osnovna ideja ELISA je, da se tarčna molekula veže na površino plastične posode (mikrotitracijska plošča), nato pa se nanjo veže specifično protitelo. Protibolečinski (detekcijski) sistem običajno vključuje protitelo povezano z encimom (npr. HRP — peroksidaza ali AP — alkalna fosfataza). Ko se doda ustrezen encimski substrat, encim katalizira kemijsko reakcijo, ki proizvaja merljiv signal (barvo, svetlobo ali fluorescenco). Intenzivnost signala je sorazmerna količini tarče v vzorcu.

Glavne oblike ELISA

• Direktna ELISA: tarča se prepozna neposredno z encimsko konjugiranim primarnim protitelesom. Hitra, vendar manj občutljiva.
• Indirektna ELISA: tarča se prepozna z neoznačenim primarnim protitelesom, nato pa z encimsko označenim sekundarnim protitelesom, ki se veže na primarno protitelo. Poveča občutljivost zaradi več sekundarnih protiteles na primarno protitelo.
• Sandwich (sendvič) ELISA: uporablja "zajetno" (capture) protitelo, pritrjeno na ploščo, ki ujame tarčo, in nato encimsko označeno detekcijsko protitelo. Zelo primerna za kompleksne vzorce in zagotavlja visoko specifičnost in občutljivost.
• Konkurentna (competitive) ELISA: signal se zmanjša ob prisotnosti tarče v vzorcu, saj nepomakovano tekmovanje med označeno in neoznačeno tarčo za vezavna mesta povzroči inverzno razmerje med signalom in koncentracijo tarče.

Tipični koraki postopka

• Priprava plošče: pritrjevanje zajetnega proteina ali antigenov na stene jaškov (za sandwich ali direktno ELISA).
• Blokiranje: dodajanje blokirne raztopine (npr. bovinskega serumskega alb; ali mleka), da se zmanjša nespecifično vezanje.
• Dodajanje vzorca: inkubacija vzorca, da se tarča veže na zajetna protitelesa ali površino.
• Pranje: odstranjevanje nevezane snovi z več prali za zmanjšanje ozadja.
• Dodajanje detekcijskega protitelesa (in po potrebi sekundarnega protitela): inkubacija in nadaljnje pranje.
• Dodajanje encimskega substrata: nastanek barve, fluorescenčnega ali kemiluminiscenčnega signala.
• Merjenje: spektrofotometer (absorbanca), fluorometer ali luminometer, pogosto v 96-jaščno formatih za visoko prepustnost.
• Kvantifikacija: primerjava signalov s standardno krivuljo znanih koncentracij za določanje količine tarče v vzorcu.

Metode detekcije

• Kolorimetrična: najpogostejša; encim sproži obarvanje substrata (npr. TMB, pNPP) in rezultat se meri kot absorbanca pri določeni valovni dolžini.
• Fluorescenčna: uporablja fluorogene oznake; zahteva ekscitacijo in merjenje emisije (včasih v UV/vidnem območju).
• Kemiluminiscenčna: zelo občutljiva; encimska reakcija proizvede svetlobni signal, ki se meri s luminometrom.

Vzorci, kontrole in kakovost

ELISA se lahko izvaja na serumu, plazmi, homogenatih tkivih, urinu, sline ali kultivacijskih supernatantih. Zaradi matriknih učinkov (npr. proteini, lipidi) je pogosto potrebno razredčenje vzorcev ali uporaba matričnih kontrol. Pomembne so vključitev pozitivnih in negativnih kontrol, praznih jaškov (blank) in standardne krivulje, da zagotovimo zanesljivost in ponovljivost rezultatov.

Uporaba

• Medicinska diagnostika: odkrivanje protiteles proti patogenom (npr. virusom, bakterijam), merjenje hormonov in biomarkerjev.
• Raziskave: kvantifikacija citokinov, rastnih faktorjev in drugih beljakovin v celičnih kulturah ali vzorcih pacientov.
• Farmacija in razvoj cepiv: spremljanje imunskega odziva, testi stabilnosti in čistosti proizvodov.
• Živilska varnost in okolje: odkrivanje alergenskih beljakovin, toksinov in kontaminantov.
• Visokoprepustno testiranje: avtomatizirane platforme v 96- ali 384-jaščnih formatih omogočajo množične preiskave.

Prednosti in omejitve

Prednosti ELISA vključujejo visoko specifičnost (pri uporabi dobrih protiteles), občutljivost, relativno nizke stroške in možnost kvantifikacije. Omejitve pa so možna navzkrižna reaktivnost protiteles, vpliv matrike vzorca, potreba po standardih in morebitna omejena linearna območja pri zelo nizkih ali zelo visokih koncentracijah. V nekaterih primerih je za zaznavanje nizkih koncentracij ali zaznavo posameznih celic razvita bolj občutljiva tehnika ELISPOT.

Interpretacija rezultatov

Rezultati se običajno predstavijo kot absorbanca (ali relativni signal), ki se pretvori v koncentracijo z uporabo standardne krivulje. Pri interpretaciji je treba upoštevati kontrolo kakovosti, mejne vrednosti testa in biološko relevantnost ugotovljenih koncentracij. Negativni rezultat ne izključuje vedno odsotnosti tarče (lahko je pod mejo zaznavnosti), medtem ko pozitiven rezultat zahteva preverjanje možnih lažno pozitivnih vzrokov.

ELISA je zato vsestranska in uporabna metoda v laboratorijih po svetu, primerna za klinične teste, raziskave in nadzor kakovosti. Z razvojem novih protiteles, oznak in instrumentov se njena občutljivost in specifičnost še naprej izboljšujeta.

Vprašanja in odgovori

V: Kaj je ELISA?

V: Kako deluje ELISA?

V: Katere snovi lahko zazna ELISA?

V: Na kaj kaže količina barve, ki jo ustvari test ELISA?

V: Ali je ELISA edina tehnika, ki se uporablja za odkrivanje določenih snovi v vzorcu?

V: Kakšna je vloga drugega sklopa protiteles, ki se uporablja pri ELISA?

V: Ali test ELISA ob zaznavi snovi vedno pokaže barvo?

Išči po črki