Plinska kromatografija-masna spektrometrija

Zgodovina

Prvi raziskovalni članki o plinsko tekočinski kromatografiji so bili objavljeni leta 1950. Kemiki so uporabljali različne detektorje, da bi ugotovili, ali spojine iztekajo iz konca kromatografa. Večina detektorjev je spojine uničevala, saj so jih sežigali ali ionizirali. Zaradi teh detektorjev so kemiki ugibali o natančni identiteti vsake spojine v vzorcu. V petdesetih letih prejšnjega stoletja sta Roland Gohlke in Fred McLafferty razvila novo kombinirano napravo. Kot detektor v plinski kromatografiji sta uporabila masni spektrometer. Te zgodnje naprave so bile velike, krhke in sprva omejene na laboratorijske prostore.

Zasnova je bila zapletena. Časovni razmik med različnimi spojinami, ki izhajajo iz kromatografa, je bilo težko nadzorovati. Tako je moral masni spektrometer končati delo na eni spojini, preden je iz kromatografa iztekla naslednja. V zgodnjih modelih so bile meritve iz masnega spektrometra zapisane na grafični papir. Visoko usposobljeni kemiki so preučevali vzorce vrhov, da bi identificirali vsako spojino. V sedemdesetih letih prejšnjega stoletja so masnim spektrometrom dodali analogno-digitalne pretvornike. To je računalnikom omogočilo shranjevanje in razlago rezultatov. Ker so bili računalniki vse hitrejši in manjši, je GC-MS postal hitrejši in se je iz laboratorijev razširil v vsakdanje življenje. Danes se računalniški instrumenti GC-MS pogosto uporabljajo pri spremljanju stanja okolja na področju vode, zraka in tal. Uporabljajo se tudi pri urejanju kmetijstva, varnosti hrane ter pri odkrivanju in proizvodnji zdravil.

Razvoj majhnih računalnikov je pripomogel k poenostavitvi naprav GC-MS. Prav tako se je močno skrajšal čas, ki je potreben za analizo vzorca. Electronic Associates, Inc. (EAI) je bil vodilni ameriški dobavitelj analognih računalnikov. Leta 1964 je EAI pod vodstvom Roberta E. Finnigana začel razvijati računalniško krmiljen masni spektrometer. Do leta 1966 je bilo prodanih več kot 500 instrumentov za analizo plinov. Leta 1967 je bilo ustanovljeno podjetje Finnigan Instrument Corporation (FIC). V začetku leta 1968 je univerzi Stanford in Purdue dostavila prve prototipne štiripolne instrumente GC-MS. Podjetje FIC se je sčasoma preimenovalo v Finnigan Corporation in se uveljavilo kot vodilno podjetje na področju sistemov GC-MS na svetu.

Osnovno delovanje

GC-MS lahko najde vse spojine, ki so pomešane skupaj v vzorcu. Operater vzorec raztopi v tekočini. Operater nato tekočino vbrizga v tok plina. (Najpogosteje se uporabljajo helij, vodik ali dušikov plin.) Plin teče skozi cev s posebno prevleko. Ker se vsaka spojina v vzorcu na prevleko prilepi na drugačen način, pride vsaka spojina iz cevi ob drugačnem času. Tako se premaz uporablja za ločevanje vsake spojine, ki je bila v vzorcu pomešana skupaj. Ko vsaka spojina pride na koncu cevi, se ionizira in dobi električni naboj. Večina spojin ob ionizaciji razpade. Različni kosi poletijo pod magnet, ki jih loči glede na njihovo težo in naboj. Računalnik nato izmeri vse dele vsake spojine. S primerjavo meritev z računalniško knjižnico znanih spojin računalnik sestavi seznam imen vseh spojin v vzorcu. Računalnik lahko tudi ugotovi, koliko vsake spojine je bilo v vzorcu.

Instrumentacija

GC-MS je sestavljen iz dveh glavnih gradnikov: plinskega kromatografa in masnega spektrometra. Plinski kromatograf uporablja kapilarno kolono, ki je odvisna od dimenzij kolone (dolžina, premer, debelina plasti) in lastnosti faze (npr. 5 % fenil polisiloksan). Razlika v kemijskih lastnostih med različnimi molekulami v zmesi bo ločila molekule, ko bo vzorec potoval po dolžini kolone. Molekule potrebujejo različno veliko časa (imenovanega retencijski čas), da pridejo iz plinskega kromatografa (eluirajo se iz njega). To omogoča, da masni spektrometer, ki se nahaja za njim, ločeno zajame, ionizira, pospeši, odkloni in zazna ionizirane molekule. Masni spektrometer to stori tako, da vsako molekulo razbije na ionizirane fragmente in te fragmente zazna z razmerjem med maso in nabojem.

Ta dva stroja, ki se uporabljata skupaj, omogočata veliko večjo natančnost identifikacije snovi kot obe enoti, ki se uporabljata ločeno. S samo plinsko kromatografijo ali masno spektrometrijo ni mogoče natančno identificirati določene molekule. Postopek masne spektrometrije običajno zahteva zelo čist vzorec. V preteklosti so pri plinski kromatografiji uporabljali druge detektorje, kot je plamensko ionizacijski detektor. Ti detektorji ne morejo ločiti različnih molekul, ki potujejo skozi kolono enako dolgo. (Kadar imata dve različni molekuli enak zadrževalni čas, pravimo, da se "koeluirata"). Molekuli, ki se skupaj izločata, zmedeta računalniške programe, ki za obe molekuli odčitavajo en sam masni spekter.

Včasih imata lahko dve različni molekuli tudi podoben vzorec ioniziranih fragmentov v masnem spektrometru (masni spekter). Združevanje obeh postopkov zmanjša možnost napake. Zelo malo verjetno je, da bi se dve različni molekuli obnašali enako v plinskem kromatografu in masnem spektrometru. Če se torej masni spekter ujema z želenim analitom, lahko retencijski čas tega spektra primerjamo z značilnim retencijskim časom plinskega aparata, da bi povečali gotovost, da je analit v vzorcu.

Vrste detektorjev masnih spektrometrov

Najpogostejša vrsta MS, ki je povezana z GC, je kvadrupolni masni spektrometer. Hewlett-Packard (zdaj Agilent) ga trži pod trgovskim imenom "masno selektivni detektor" (MSD). Drugi razmeroma pogost detektor je masni spektrometer z ionsko pastjo. Poleg tega lahko najdemo tudi masni spektrometer z magnetnim sektorjem. Vendar so ti instrumenti dragi in obsežni ter jih običajno ne najdemo v laboratorijih z visoko zmogljivostjo. Uporabljajo se tudi drugi detektorji, kot so čas leta (TOF), tandemski kvadrupoli (MS-MS) (glej spodaj) ali v primeru MS z ionsko pastjo ⁿ. Številka n označuje število stopenj masne spektrometrije.

Notranjost plinskega kromatografa GC-MS, s kolono plinskega kromatografa v pečici na desni.


Shema GC-MS

Analiza

Masni spektrometer se običajno uporablja na dva načina: Celotno skeniranje ali selektivno spremljanje ionov (SIM). Tipičen GC-MS lahko deluje na oba načina ali na oba hkrati.

Celotno skeniranje MS

Pri zbiranju podatkov v načinu popolnega skeniranja se izbere ciljno območje masnih fragmentov in se vnese v metodo instrumenta. Primer tipičnega širokega razpona masnih fragmentov, ki jih je treba spremljati, je m/z 50 do m/z 400. Razpon, ki ga je treba uporabiti, je v veliki meri odvisen od tega, kaj se pričakuje v vzorcu, pri čemer je treba upoštevati topilo in druge možne motnje. Če MS išče masne fragmente z zelo nizkimi m/z, lahko zazna zrak ali druge možne moteče dejavnike. Uporaba velikega območja skeniranja zmanjša občutljivost instrumenta. Naprava bo opravila manj skeniranj na sekundo, ker bo vsako skeniranje trajalo dlje časa, da bi zaznala širši razpon masnih fragmentov.

Celotno skeniranje je uporabno za določanje neznanih spojin v vzorcu. Zagotavlja več informacij kot SIM, ko gre za potrjevanje ali razločevanje spojin v vzorcu. Večino instrumentov upravlja računalnik, ki upravlja računalniški program, imenovan "metoda instrumenta". Metoda instrumenta nadzoruje temperaturo v GC, hitrost skeniranja MS in razpon velikosti zaznanih fragmentov. Ko kemik razvija instrumentalno metodo, pošlje preskusne raztopine skozi GS-MS v načinu popolnega skeniranja. Pri tem preveri zadrževalni čas GC in prstni odtis masnega fragmenta, preden preide na instrumentalno metodo SIM. Specializirani instrumenti GC-MS, kot so detektorji eksplozivov, imajo tovarniško vnaprej naloženo instrumentalno metodo.

Spremljanje izbranih ionov

Pri spremljanju izbranih ionov (SIM) se instrumentalna metoda osredotoča na določene ionske fragmente. Masni spektrometer zazna samo te masne fragmente. Prednosti metode SIM so, da je meja zaznavnosti nižja, saj instrument med vsakim skeniranjem pregleda le majhno število fragmentov (npr. tri fragmente). Vsako sekundo se lahko opravi več skeniranj. Ker se spremlja le nekaj masnih fragmentov, ki nas zanimajo, so motnje v matrici običajno manjše. Da bi izboljšali možnosti za pravilno odčitavanje pozitivnega rezultata, so ionska razmerja različnih masnih fragmentov primerljiva z znanim referenčnim standardom.

Vrste ionizacije

Ko molekule prepotujejo celotno dolžino kolone, gredo skozi prenosno linijo in vstopijo v masni spektrometer, se z različnimi metodami ionizirajo. Običajno se v danem trenutku uporablja le ena metoda ionizacije. Ko je vzorec razdrobljen, ga je treba zaznati, običajno z elektronsko multiplikatorsko diodo. Dioda obravnava ioniziran masni fragment kot električni signal, ki ga nato zazna.

Kemiki izberejo tehniko ionizacije ločeno od izbire polnega skeniranja ali spremljanja SIM.

Ionizacija elektronov

Najpogostejša vrsta ionizacije je elektronska ionizacija (EI). Molekule vstopijo v MS (vir je kvadrupol ali sama ionska past v MS z ionsko pastjo), kjer jih zadenejo prosti elektroni, ki jih oddaja žarilna nitka. To je podobno žarilni nitki, ki jo najdemo v standardni žarnici z žarilno nitko. Elektroni zadenejo molekule in povzročijo, da se molekula fragmentira na značilen način, ki se lahko ponovi. Ta tehnika "trde ionizacije" povzroči nastanek več fragmentov z nizkim razmerjem med maso in nabojem (m/z). Pri EI je fragmentov z maso, ki je blizu masi prvotne molekule, malo, če sploh kakšni. Kemiki menijo, da je trda ionizacija streljanje elektronov v molekule vzorca. Nasprotno pa "mehka ionizacija" pomeni, da se molekuli vzorca doda naboj z udarcem vnesenega plina. Vzorec fragmentacije molekul je odvisen od energije elektronov, ki se uporabi v sistemu, običajno 70 eV (elektronvoltov). Uporaba 70 eV pomaga primerjati spektre, ustvarjene iz preskusnega vzorca, z znanimi spektri iz knjižnice. (Knjižnični spektri so lahko pridobljeni s programsko opremo, ki jo zagotovi proizvajalec, ali s programsko opremo, ki jo razvije Nacionalni inštitut za standarde (NIST-USA)). Programska oprema išče knjižnične spektre z uporabo algoritma za ujemanje, kot je ujemanje na podlagi verjetnosti ali ujemanje s točkovnim produktom. Te algoritme in metode zdaj nadzorujejo številne agencije za standardizacijo metod, da bi zagotovile njihovo objektivnost.

Kemična ionizacija

Pri kemični ionizaciji (CI) se v masni spektrometer dovaja reagentni plin, običajno metan ali amoniak. Poznamo dve vrsti CI: pozitivno in negativno CI. V obeh primerih reagentni plin sodeluje z elektroni in analitom ter povzroči "mehko" ionizacijo zanimive molekule. Pri mehkejši ionizaciji se molekula drobi v manjši meri kot pri trdi ionizaciji pri EI. Kemiki imajo raje CI kot EI. CI namreč ustvari vsaj en masni fragment z maso, ki je skoraj enaka molekulski masi analita, ki ga zanima.

Pozitivna kemična ionizacija

Pri pozitivni kemični ionizaciji (PCI) reagentni plin reagira s ciljno molekulo, najpogosteje z izmenjavo protonov. Pri tem nastanejo ionske vrste v razmeroma velikih količinah.

Negativna kemična ionizacija

Pri negativni kemični ionizaciji (NCI) reagenčni plin zmanjša vpliv prostih elektronov na ciljni analit. Zaradi te zmanjšane energije je fragment običajno v odlični oskrbi. (Fragmenti ne razpadejo naprej.)

Tolmačenje

Glavni cilj instrumentalne analize je izmeriti količino snovi. To dosežemo s primerjavo relativnih koncentracij atomskih mas v ustvarjenem masnem spektru. Možni sta dve vrsti analize, primerjalna in izvirna. Primerjalna analiza v bistvu primerja dani spekter s knjižnico spektrov, da bi ugotovila, ali so njegove značilnosti prisotne za nek znan vzorec v knjižnici. To je najbolje opraviti z računalnikom, saj lahko pride do številnih vizualnih popačenj zaradi sprememb v merilu. Računalniki lahko korelirajo tudi več podatkov (kot so retencijski časi, ki jih določi GC), da se natančneje povežejo določeni podatki.

Druga metoda analize meri vrhove v medsebojnem razmerju. Pri tej metodi je najvišji vrh nastavljen na 100 %. Ostalim vrhovom je dodeljena vrednost, ki je enaka razmerju med višino vrha in višino najvišjega vrha. Vse vrednosti nad 3 % so dodeljene. Skupna masa neznane spojine je običajno označena z matičnim vrhom. Vrednost tega matičnega vrha se lahko uporabi za prileganje kemijski formuli, ki vsebuje različne elemente, za katere se domneva, da so v spojini. Izotopski vzorec v spektru je edinstven za elemente, ki imajo veliko izotopov. Zato ga lahko uporabimo tudi za identifikacijo različnih prisotnih elementov. To pove celotno kemijsko formulo neznane molekule. Ker struktura molekule in vezi razpadajo na značilne načine, jih lahko prepoznamo na podlagi razlike v masah vrhov. Identificirana struktura molekule mora biti skladna z značilnostmi, ki jih zabeleži GC-MS. Običajno to identifikacijo samodejno opravijo računalniški programi, ki so priloženi instrumentu. Ti programi primerjajo spektre s knjižnico znanih spojin, ki imajo enak seznam elementov, ki bi lahko bili prisotni v vzorcu.

Pri analizi "celotnega spektra" se upoštevajo vsi "vrhovi" v spektru. Pri selektivnem spremljanju ionov (SIM) pa se spremljajo le izbrani vrhovi, povezani z določeno snovjo. Kemiki domnevajo, da je pri določenem času zadrževanja niz ionov značilen za določeno spojino. SIM je hitra in učinkovita analiza. SIM se najbolje obnese, kadar ima analitik predhodne informacije o vzorcu ali kadar išče le nekaj specifičnih snovi. Ko se količina zbranih informacij o ionih v določenem plinskem kromatografskem vrhu zmanjša, se poveča občutljivost analize. Tako analiza SIM omogoča zaznavanje in merjenje manjše količine spojine. Vendar se zmanjša stopnja gotovosti glede identitete te spojine.

GC-tandemska MS

Če se doda druga faza masne fragmentacije, na primer z uporabo drugega kvadrupola v kvadrupolnem instrumentu, se to imenuje tandemska MS (MS/MS). MS/MS je dober za merjenje nizkih ravni ciljnih spojin v vzorcu z matrico spojin iz ozadja, ki niso zanimive.

Prvi kvadrupol (Q1) je povezan s kolizijsko celico (q2) in drugim kvadrupolom (Q3). Oba kvadrupola se lahko uporabljata v skenirajočem ali statičnem načinu, odvisno od vrste uporabljene analize MS/MS. Vrste analize vključujejo skeniranje produktnih ionov, skeniranje predhodnih ionov, spremljanje izbranih reakcij (SRM) in skeniranje nevtralnih izgub. Na primer: Če je Q1 v statičnem načinu (gledamo samo eno maso kot pri SIM), Q3 pa je v načinu skeniranja, dobimo tako imenovani produktni ionski spekter (imenovan tudi "hčerinski spekter"). Iz tega spektra lahko izberemo izrazit produktni ion, ki je lahko produktni ion za izbrani predhodni ion. Ta par se imenuje "prehod" in je osnova za SRM. SRM je zelo specifičen in skoraj v celoti odpravlja matrično ozadje.

Aplikacije

Spremljanje in čiščenje okolja

Številni kemiki menijo, da je GC-MS najboljše orodje za spremljanje organskih onesnaževal v okolju. Stroški opreme GC-MS so se zelo znižali. Hkrati se je povečala zanesljivost GC-MS. Obe izboljšavi sta povečali uporabo v okoljskih študijah. Nekaterih spojin, kot so nekateri pesticidi in herbicidi, z GS-MS ni mogoče identificirati. So preveč podobne drugim sorodnim spojinam. Toda za večino organskih analiz okoljskih vzorcev, vključno s številnimi glavnimi razredi pesticidov, je GC-MS zelo občutljiv in učinkovit.

Kriminalistična forenzika

Z metodo GC-MS lahko analizirate delce iz človeškega telesa in tako pomagate povezati zločinca s kaznivim dejanjem. Zakon dovoljuje uporabo GC-MS za analizo ostankov požara. Ameriško združenje za preskušanje materialov (ASTM) ima standard za analizo ostankov požara. Tehnologija GCMS/MS je pri tem še posebej uporabna, saj vzorci pogosto vsebujejo zelo zapletene matrice, rezultati, ki se uporabljajo na sodišču, pa morajo biti zelo natančni.

Pravosodni organi

GC-MS se uporablja za odkrivanje prepovedanih drog in lahko sčasoma nadomesti pse, ki iščejo droge. Pogosto se uporablja tudi v forenzični toksikologiji. Pomaga pri iskanju drog in/ali strupov v bioloških vzorcih, odvzetih osumljencem, žrtvam ali truplom.

Varnost

Po terorističnih napadih 11. septembra 2001 so sistemi za odkrivanje eksplozivov postali del vseh ameriških letališč. Ti sistemi uporabljajo številne tehnologije, od katerih številne temeljijo na GC-MS. FAA je certificirala le tri proizvajalce, ki zagotavljajo te sisteme. Prvi je Thermo Detection (prej Thermedics), ki proizvaja EGIS, linijo detektorjev eksplozivov na osnovi GC-MS. Drugi je Barringer Technologies, ki je zdaj v lasti podjetja Smith's Detection Systems. Tretji je Ion Track Instruments (del podjetja General Electric Infrastructure Security Systems).

Analiza živil, pijač in parfumov

Živila in pijače vsebujejo veliko aromatičnih spojin, od katerih so nekatere naravno prisotne v surovinah, nekatere pa nastanejo med predelavo. GC-MS se pogosto uporablja za analizo teh spojin, ki vključujejo estre, maščobne kisline, alkohole, aldehide, terpene itd. Uporablja se tudi za odkrivanje in merjenje kontaminantov, ki so posledica kvarjenja ali ponarejanja in so lahko škodljivi. Onesnaževala pogosto nadzorujejo vladne agencije, na primer pesticidi.

Astrokemija

Več GC-MS je zapustilo Zemljo. Dva sta odletela na Mars v okviru programa Viking. Venera 11 in 12 ter Pioneer Venus so z GC-MS analizirali atmosfero Venere. Sonda Huygens v okviru misije Cassini-Huygens je na Saturnovi največji luni, Titanu, pristala z enim GC-MS. Material na kometu 67P/Čurjumov-Gerasimenko bo leta 2014 analizirala misija Rosetta s kiralnim GC-MS.

Medicina

GC-MS se uporablja pri presejalnih testih za novorojenčke. Ti testi lahko odkrijejo več deset prirojenih presnovnih bolezni (znanih tudi kot prirojene napake presnove). Z GC-MS lahko določimo spojine v urinu tudi v zelo majhnih količinah. Te spojine običajno niso prisotne, vendar se pojavijo pri posameznikih s presnovnimi motnjami. To postaja običajen način diagnosticiranja IEM za zgodnejše postavljanje diagnoze in začetek zdravljenja. To sčasoma privede do boljšega izida. Zdaj je mogoče novorojenčka ob rojstvu testirati za več kot 100 genetskih presnovnih motenj s testom urina na podlagi GC-MS.

V kombinaciji z izotopskim označevanjem presnovnih spojin se GC-MS uporablja za določanje presnovne aktivnosti. Večina aplikacij temelji na uporabi ¹³C kot označevalca in merjenju razmerja ¹³C-¹² C z masnim spektrometrom z izotopskim razmerjem (IRMS). IRMS je masni spektrometer z detektorjem, namenjen merjenju nekaj izbranih ionov in vračanju vrednosti kot razmerja.